Метод обнаружения спор

Методы выявления спор у бактерий

Окраска спор по методу Ожешки: 1. На нефиксированный мазок наносят 0,5% раствор хлористоводородной кислоты и подогревают на пламени горелки в течение 2-3 минут. 2. Кислоту сливают, препарат промывают водой, просушивают и фиксируют над пламенем горелки. 3. Окрашивают препарат по Цилю-Нильсену. Споры бактерий при этом приобретают красный цвет, а вегетативные формы – синий.

Также споры не окрашиваются при простых методах окрашивания, и при микроскопии выглядят блестящими.

18. Что такое нумерическая таксономия?

Нумерическая таксономия. Признает равноценность всех признаков. Видовая принадлежность устанавливается по числу совпадающих признаков. Размеры, форма, взаиморасположение.

19. Что такое конститутивные, индуцибельные, репрессибельные ферменты?

Расскажу вам сказочку. жили три брата.
Первый брат — работает всегда, есть кризис, нет, всегда ему будет работа. Например парикмахер, или там гробовщик, ну ладно, водитель такси.

Второй брат — сезонные работы — его канёк, когда есть работа, он везде, его много, но как-то только сезон проходит, он больше никому не нужен до следующего момента.

Третий брат, работает-работает, но перехватили его работу, то, что должен продуцировать — уже очень много, и поэтому он сидит тихо, пока не потребуется.

Конститутивные – это ферменты микроорганизов, всегда синтезирующиеся с постоянной скоростью и присутствующие в клетке в постоянных концентрациях (синтез их запрограммирован), например, ферменты гликолитического пути;

Индуцибельные (адаптивные) – это ферменты, концентрация которых резко изменяется в зависимости от наличия или отсутствия в среде субстрата;

Репрессибельные – это ферменты, синтез которых подавляется в результате избыточного накопления продукта реакции, катализируемой данным ферментом.

Основные методы лабораторного выявления бактерий

Метод изучения – определенная совокупность действий, которая позволяет исследователю достичь цели исследования. Основой для бактериологических изысканий являются методы общей микробиологии. Именно на них основан метод выявления бактерий рода Salmonella и других опасных для человека микробов, а также обнаружение прокариотов в окружающей среде для других утилитарных целей.

Где и зачем искать?

Проверять пищу человека на содержание в ней разных видов микроорганизмов – общеизвестная задача микробиологических исследований на выявление штаммов бактерий с разной степенью вирулентности.

Однако ввиду стремительного развития биотехнологий, необходимость выявлять определенные виды микроорганизмов может возникать в самых разных отраслях жизнедеятельности человека:

• медицина и ветеринария;
• фармацевтика;
• пищевая промышленность;
• сельское хозяйство и переработка сельскохозяйственных продуктов;
• химическая промышленность.

Кроме того, выявление прокариотов с целью их изучения – одна из самых актуальных задач микробиологов, которые сегодня только начинают знакомиться с огромным разнообразием представителей безъядерной органики.

При работе с тем или иным биологическим материалом в микробиологических лабораториях используются несколько основных методов:

• микроскопия (световая, электронная);
• биологические методы (культивирование и идентификация организмов);
• молекулярно-генетический метод;
• серологический (выявление антигенов).

Эти основные методы позволяют не только обнаружить не видимые невооруженным глазом бактериальные клетки, а и изучить их структурные элементы и фазы жизнедеятельности.

Данные о структуре и жизненных процессах изучаемых бактерий позволяют идентифицировать выделенный биологический материал и соотнести его с теми видами прокариотов, которые уже описаны в микробиологической литературе или же зарегистрировать открытие новых видов безъядерных организмов.

Оборудование микробиологической лаборатории

Возможность применять методы выявления клеток бактерий может присутствовать только в рамках организации бактериологической лаборатории. Это специально оборудованные комплексы, которые функционируют:

• при поликлиниках и диспансерах;
• при санитарно-эпидемиологических станциях или их подразделениях;
• при научно-исследовательских центрах;
• при предприятиях по выпуску биопрепаратов.

Практически все перечисленные лаборатории работают с прокариотами низкой и средней степени вирулентности (опасности для человека). Опасные бактерии можно исследовать только в специализированных лабораториях.

Основу лаборатории составляют:

• термостат для регулировки и поддержания стабильных температурных режимов;
• микроанаэростат для поддержания анаэробной среды;
• холодильник для хранения сред, проб и микроорганизмов;
• центрифуги для осаждения исследуемого материала со стенок пробирок;
• печь Пастера для воздушной стерилизации лабораторных приборов;
• автоклав для стерилизации под давлением.

Кроме перечисленных аппаратов, лаборатория также оснащена микроскопами, планшетами, дозирующими приборами, наконечниками и бактериологическими анализаторами в зависимости от специфики лаборатории.

Методы выявления некоторых бактерий

Сальмонелла – патогенный бактериологический агент, который может инфицировать человека через пищу. Для своевременного изолирования зараженных продуктов и их утилизации разработан и утвержден ГОСТом в 1998 году метод выявления бактерий рода Salmonella в пищевых продуктах.

Суть метода состоит в следующем:

1. Пробу продукта высевают на неселективную питательную среду (питательный бульон, на котором может расти большинство микроорганизмов).
2. Посев выдерживается при стабильной температуре (инкубирование).
3. Производят подбор селективной среды (той, на которой растут только сальмонеллы).
4. Выполняют пересадку выросших бактериальных колоний на селективную для сальмонелл среду.
5. Регистрируют результаты.

Методология определяет все нюансы проведения исследования: от количества проб до состава питательных сред и посуды, которая может использоваться работниками лаборатории для получения достоверных результатов их работы.

Listeria monocytogenes – возбудитель бактериальной инфекции листериоза

При поражении человеческого организма Listeria monocytogenes становятся внутриклеточными паразитами (бактериальные клетки проникают внутрь эукариотических). Через некоторое время их обнаруживают в клетках практически всех внутренних органов человека, поскольку эти бактерии распространяются через кровь.

По этой причине симптомы бактериального заражения могут проявляться в разной форме: ангина, менингит, конъюнктивит и т.д., любые формы сепсиса (заражения внутренних органов).

Для предотвращения этой бактериальной угрозы разработаны и утверждены методы выявления Listeria monocytogenes в пищевых продуктах.

Для целей выявления Listeria monocytogenes нормативные акты определяют их как грамположительные неспорообразующие бактериальные палочки, которые растут на плотных селективных средах. Формы их колоний – короткие цепочки, иногда длинные нити.

1. Для исследования отбирается проба, которая рассеивается на питательной среде, подходящей для большого количества микроорганизмов, и инкубируется в течение суток при температуре 30°С.
2. В связи с тем, что чаще всего Listeria monocytogenes находится в продукте в небольшом количестве, на следующем этапе их выявления имеющуюся среду обогащают специально подобранными для Listeria monocytogenes питательными элементами (делают питательную среду более селективной) и выдерживают в течение 2-х суток при температуре 37°С.
3. Полученные колонии пересевают на две питательные среды: по Оттавиани и Агости (ALOA) и одну из трех (Оксфорд агар, Палкам агар, ПАЛ – питательный агар для выделения листерий). Первый посев инкубируют сутки при температуре 37°С, после чего регистрируют наличие или отсутствие колоний, характерных для Listeria monocytogenes. Второй посев выдерживают чуть дольше (на 3 часа) и также регистрируют возможные проявления колоний Listeria monocytogenes.

Возможные проявления наличия бактериальных колоний Listeria monocytogenes выглядят следующим образом:

1. Колонии клеток имеют сине-зеленую окраску. Кроме того, вокруг колонии наблюдается непрозрачный ореол.
2. Поврежденные бактериальные клетки не дают характерного ореола или он только едва заметен.
3. На ПАЛ-агаре колонии имеют серо-зеленый или оливково-зеленый цвет. Их окружает ореол черного цвета. Иногда колония имеет черный центр.

После выявления колоний Listeria monocytogenes их начинают изучать более подробно:

• производят реакцию на каталазу;
• окрашивают по Граму;
• определяют подвижность;
• проверяют на бета-гемолитическую активность и т.д.

Также сегодня в лабораториях есть материал для проведения экспресс-анализов по специализированным таблицам, которые изготавливаются под каждый вид продуктов либо другого исследуемого материала. Их можно приобрести в специализированных магазинах, как и другое лабораторное оборудование.

Выявление отдельных клеточных структур

Выявление жгутиков позволяет идентифицировать бактериальные клетки по типу подвижности.

Обнаружить клеточную структуру не так просто, как найти саму бактерию. Для этих целей используются разные способы окраски жгутиков.

Способ окраски жгутиков заключается в том, что разные по составу красители оседают на их поверхности. В результате такого оседания жгутики утолщаются. Кроме того, уменьшается прозрачность как всей клетки, так и самого жгутика (бактериальная клетка в обычных условиях практически прозрачная).

Метод окраски жгутиков по Цилю предполагает следующую технологию выполнения:

1. Каплю водного раствора с чистой культурой наносят на предметное стекло и высушивают в естественных условиях.
2. Бактерий протравливают специальным раствором на основе спирта, сернокислого железа и танина, поскольку пока бактерии живы, окрасить их жгутики невозможно.
3. После этого их прокрашивают карболовым фуксином Циля.
4. Предметное стекло промывают водой и просушивают.

После всех проведенных процедур жгутики будут видны в микроскоп как тоненькие ниточки.

Обнаружение капсул

Капсула также является клеточной структурой, которая присуща не всем бактериям и по которой прокариота можно идентифицировать.

Методы выявления капсул также основаны на окрашивании органическими анилиновыми красителями.

Окраска капсулы по Романовскому-Гимзе происходит по следующей технологии:

1. На предметное стекло наносится мазок разведенной чистой культуры.
2. Стекло устанавливается мазком вниз в чашку Петри на стеклянные подставки.
3. В чашку Петри добавляют 20 капель краски Романовского-Гимзе.
4. Через 15-20 минут предметное стекло промывают и высушивают.
5. В результате бактерии окрашиваются в темно-синий цвет, а капсулы приобретают розовую окраску.

Окраска по Михину – выявление капсул при помощи метиленовой сини Леффера. При этой окраске капсулы также приобретают розовый цвет, а бактерии – синий.

Особенности окраски капсул связаны с их составом. Капсула состоит из полисахаридов или полипептидов (капсула сибирской язвы), которые быстро вступают в реакцию с теми красителями, которые используются в лабораториях.

Споры не окрашиваются теми простыми красителями, которые используются для более восприимчивых клеточных структур. При использовании этих способов споры остаются бесцветными.

Однако выявление спор является важным моментом, поскольку спороносные бактерии чаще всего обладают высокой патогенностью. Кроме того, ввиду повышенной кислотоустойчивости, тепло- и светоустойчивости, споры очень сложно ликвидировать.

Для выявления спор были разработаны специальные протравы, которые разрыхляют кислотоустойчивую оболочку, что позволяет красителю проникнуть внутрь.

Окрашивание спор по методу Меллера:

• мазок помещают на две минуты в хлороформ;
• обрабатывают 5% водным раствором хромовой кислоты;
• промывают в воде и окрашивают карболовым фуксином.
• споры окрашиваются в красный цвет.

Есть еще несколько методов выявления таких клеточных структур, как споры, и все они предполагают первоначальное воздействие на устойчивую стенку споры.

Выявление клеточной стенки

Клеточная стенка бактерии – уникальная структура. Только у прокариотов есть клеточные стенки, и именно благодаря этим стенкам можно производить первичную идентификацию безъядерных организмов.

Стенка прокариотической клетки состоит из белка муреина. Исходя из того, что стенки бывают однослойные и многослойные, датский врач Грам предложил способ выявления сильных патогенов по окрашиванию их стенки. Способ предполагает, что многослойные стенки не отреагируют на окрашивание и останутся бесцветными (грамотрицательные), а однослойные стенки приобретут синюю окраску.

Роль цитоплазматической мембраны и ее образований

Цитоплазматическая мембрана – важная часть клетки, которая обеспечивает связь между цитоплазмой и клеточной стенкой.

Выявить цитоплазматическую мембрану окрашиванием не представляется возможным. Кроме того, в этом нет никакой практической необходимости, поскольку цитоплазматическая мембрана – обязательная структура каждой бактериальной клетки.

Цитоплазматическая мембрана имеет практически всегда один и тот же биохимический состав. Для изучения структур клетки и ее включений необходимо изучение проводящих функций цитоплазматической мембраны. Эти исследования осуществляются такими бактериологическими методами, как молекулярно-генетический и серологический.

Методы выявления капсул, жгутиков, спор

Для выявления некоторых бактерий и отдельных структур клеток применяют специальные методы окраски.

Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля-Нильсена:

1. На фиксированный мазок наносят карболовый раствор фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогревают до появления паров в течение 3-5 минут.

2. Снимают бумагу, промывают мазок водой.

3. На мазок наносят 5% раствор серной кислоты или 3% раствор солянокислого спирта на 1-2 минуты для обесцвечивания.

4. Промывают водой.

5. Докрашивают мазок водным раствором метиленового синего в течение 3-5 минут.

6. Промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Выявление капсулы по методу Гинса:

1. На предметное стекло наносят каплю туши, а рядом – каплю исследуемого материала. Обе капли тщательно перемешивают и с помощью шлифованного стекла готовят мазок.

2. Мазок высушивают на воздухе и фиксируют на пламени горелки.

3. Мазок окрашивают фуксином в разведении 1:3 или сафранином. При этом бактерии окрашиваются в красный цвет, капсулы остаются неокрашенными и выделяются на темном фоне препарата.

Окраска жгутиков по Леффлеру:

1. Взвесь бактерий переносят в каплю воды, не перемешивают и высушивают.

2. Обрабатывают препарат 15-20 минут протравой (1 мл насыщенного спиртового раствора фуксина + смесь из 10 мл 25% водного раствора танина с 5 мл насыщенного водного раствора сернокислого железа).

3. Тщательно промывают водой и высушивают на воздухе.

4. Докрашивают фуксином Циля в течение 3-4 минут при легком подогревании.

5. Промывают водой, высушивают, микроскопируют.

Окраска спор по методу Ожешки:

1. На нефиксированный мазок наносят 0,5% раствор хлористоводородной кислоты и подогревают на пламени горелки в течение 2-3 минут.

2. Кислоту сливают, препарат промывают водой, просушивают и фиксируют над пламенем горелки.

3. Окрашивают препарат по Цилю-Нильсену. Споры бактерий при этом приобретают красный цвет, а вегетативные формы – синий.

Изучение микробов в живом состоянии

Клетки микроорганизмов в живом состоянии изучают методом раздавленной капли и методом висячей капли.

Метод раздавленной капли. На поверхность обезжиренного предметного стекла наносят каплю исследуемого материала или суспензию бактерий и покрывают ее покровным стеклом. Капля должна быть небольшой, не выходящей за края покровного стекла. Микроскопируют препарат с объективом х40. Метод раздавленной капли удобен для исследования подвижности бактериальных клеток, а так­же для изучения крупных микроорганизмов — плесневых грибов, дрожжей.

Метод висячей капли. Препарат готовят на покровном стекле, в центр которого наносят каплю бактериальной суспензии. Затем предметное стекло с лункой, края которого предварительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки. Препарат переворачивают покровным стеклом вверх. В правильно приготовленном препарате капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь ее дна или края. Для микроскопии используют вначале малый сухой объектив х8, под увеличением которого находят края капли, а затем устанавливают объектив х40 и исследуют препарат.

Контрольные вопросы по теме занятия:

1. Простые методы окраски микробов.

2. Сложные методы окраски микробов.

3. Сущность окраски микробов по Граму.

4. Техника окраски микробов по Граму.

5. Структура бактериальной клетки.

6. Методы обнаружения капсул, жгутиков, спор.

7. Методы изучения микробов в живом состоянии.

Литература для подготовки к занятию:

1. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. А.А. Воробьева. М., 2004.

1. Л.Б. Борисов. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., 2002.

2. О.К. Поздеев. Медицинская микробиология. М., ГЭОТАР-МЕДИА, 2005.

Споры. Спорогенез. Методы выявления спор

· Спора это форма покоящейся бактерии с Гр(+) типом строения клеточной стенки.

· Образуются при неблагоприятных условиях для бактерии.

· Споры могут образовывать только палочковидные бактерии рода Bacillus .

· Спора нужна для сохранения вида, спора не является способом размножения.

· Споры очень устойчивы во внешней среде и погибают только при стерилизации.

Строение спор:

· Кора (дипиколинат Са)

· Экзоспориум – 3-х слойная липопротеиновая оболочка

Расположение спор:

· Центральное расположение (Clostridium perftingen – возбудитель газовой гангрены)

· Субтерминальное расположение – теннисная ракетка (Clostridium botilium – ботулизма)

· Термальное расположение – барабанная палочка – когда ø споры больше сечения бактерии (Clostridium tetani – столбняк).

Окраска спор:

Споры кислотоустойчивы, поэтому окрашиваются по методу Ауески или по методу Циля–Нильсена в красный цвет, а вегетативная клетка бактерии в синий цвет.

Жгутики. Строение, функции, и способы окраски. Методы изучения подвижности бактерий. Пили.

Длинные образования из сократительного белка флагеллина, которые берут начало от бледных тел цитоплазматической мембраны. Является Н-антигеном.

· Монотрихии – один жгутик, обеспечивает быстрое движение (холерный вибрион).

· Перитрихии – очень много жгутиков по всех поверхности, движение очень медленное (возб. бр тифа)

· Лофотрихии – пучок жгутиков на одном полюсе клетки.

· Амфитрихии – по одному жгутику или пучку жгутиков на полюсах, движение минимальное

Жгутики очень редко и слабо окрашиваются.

Окраска жгутиков:

Методика по Морозову: протравление жгутиков фенолом или кислотой и окраска серебром.

Методы изучения подвижности бактерий.

Метод раздавленной капли

Метод висячая капля с использованием фазово-контрастной микроскопии.

Пили.

Пили (ворсинки или фимбрии) это тонкие нитевидные образования у Гр (–) бактерий, состоят из белка пилина, обладабт высокой антигенный активностью.

Различают пили, ответственные за адгезию (прикрепление бактерий к поражаемой клетке), ответственные за питание, водно-солевой обмен и половые или коньюгационные (F-пили).

· Общие пили – несколько сотен на клетку.

· Половые пили (sex pili) – обычно бывает 1-3 на клетку: нужны для передачи какого либо признака от «+» ♂ к «–» ♀ клетке (может передаться а/б-резистентность).

11. Методы микроскопии: световая, темпнопольная, фазово-контрастная, электронная.

Техника микрокопирования с иммерсионным объективом:

· Включить освещение и осветить поле зрения используя вогнутую поверхность зеркала и объектив ×8, поднять конденсатор до уровня столика.

· На мазок нанести небольшую каплю иммерсионного масла, помес­тить препарат на предметный столик.

· Вращая револьвер, установить объектив ×90, осторожно опустить тубус микроскопа макровинтом вниз под контролем зрения сбоку до погружения фронтальной линзы иммерсионного объектива в каплю масла (почти до соприкосновения с предметным стеклом).

· Установить ориентировочный фокус при помощи макровинта (осторожно! не повреди фронтальную линзу объек­тива или предметное стекло).

· Окончательную фокусировку осуществляют микровинтом (вра­щать в пределах одного оборота).

· После окончания работы необходимо вытереть масло с иммерсионного объектива, пере­вести револьвер на объектив ×8, выключить освещение, закрыть диафрагму микроскопа.

Темнопольная микроскопия – используют специальные конденсаторы, которые создают эффект бокового освещения. На темном фоне препарата видны светящиеся бактерии.

Фазово-контрастная микроскопия – это микроскопия живых неокрашенных бактерий, с использованием специальных объективов с фазовыми кольца м и фазовым конденсатором. При этом происходит измерение амплитуды волн невидимой фазы света, до амплитуды видимых.

studopedia.org — Студопедия.Орг — 2014-2018 год. Студопедия не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования (0.002 с) .

Методы приготовления и окрашивания микроскопических препаратов

Микроскопический метод исследования предусматривает наблюдение за живыми и убитыми бактериями в окрашенном и неокрашенном состоянии.

С целью изучения формы и подвижности бактерий микроскопию микроорганизмов можно проводить в живом состоянии без окрашивания. Для этого готовят мазки «раздавленная» и «висячая» капля и наблюдают их с помощью темнопольной и фазово-контрастной микроскопии.

Приготовление мазка «раздавленная капля».На предметное стекло по центру наносят каплю или жидкой культуры или физ.раствора, в который вносят исследуемую культуру. Нанесенную на предметное стекло каплю раздавливают с помощью покровного стекла. Затем на покровное стекло наносим каплю иммерсионного масла и микроскопируем. При фазово-контрастной микроскопии мы будем наблюдать подвижность и форму бактерий темного цвета на светлом фоне. При темнопольной микроскопии – подвижность и форму бактерий светлого цвета на темном фоне.

Для изучения микроорганизмов в окрашенном виде на предметном стекле делают мазок, высушивают, фиксируют и после этого окрашивают.

Различают простые и сложные способы окраски. Первые основаны на применении какой–либо одной краски (или метиленового синего или фуксина). Сложные методы предусматривают воздействие на один и тот же препарат двух красок. Сложные методы окраски позволяют обнаруживать в теле микробной клетки различные структурные элементы (капсулы, споры, включения).

Предметные и покровные стекла, употребляемые для приготовления препаратов должны быть чистыми и хорошо обезжиренными (с помощью хозяйственного мыла).

Из жидких культур каплю материала наносят на предметное стекло и размазывают петлей. Из культуры на плотной среде петлей берут частичку, размешивают в заранее нанесенной на предметное стекло капле физиологического раствора и размазывают по стеклу. Мазку дают высохнуть на воздухе, затем его фиксируют над пламенем спиртовки (горелки), держа стекло мазком вверх, и трижды проводят через пламя спиртовки. Время фиксации не должно превышать 5-6с. Кроме жара, для фиксации используют 96 град. спирт, погружая в него мазок на 15-20мин. После фиксации мазок готов к окрашиванию.

Методика окраски по Граму.Особенностью окраски по Грамму является неодинаковое отношение различных микробов к красителям. Микробы, входящие в группу грамположительных, например стафилококки, стрептококки, дают прочное соединение с красителями и йодом. Окрашенные микробы не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином грамположительные микробы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет. Это объясняется строением клеточной стенки грамположительных бактерий. Основным компонентом толстой клеточной стенки этих бактерий является многослойный пептидогликан, с которым ковалентно связаны тейхоевые кислоты. Грамотрицательные бактерии (гонококки, менингококки, возбудители кишечных заболеваний) образуют с генциановым фиололетовым и йодом легко разрушающееся под действием спирта соединение, в результате чего они обесцвечиваются и затем окрашиваются фуксином в красный цвет. Клеточная стенка таких бактерий представлена тонким слоем пептидогликана.

1. На фиксированный мазок наносят раствор генцианового фиолетового на 2мин.

2. Затем сливают краситель и, не промывая мазок, наливают раствор Люголя на 1мин.

3. Сливают раствор Люголя и наносят на 30сек 96 град спирт, пока не перестанет отходить краситель.

4. Мазок промывают дистиллированной водой и окрашивают в течении 2 мин раствором фуксина.

5. После чего сливают краситель, мазок промывают водой и высушивают. Грамположительные бактерии окрашиваются в синий (фиолетовый) цвет, а грамотрицательные бактерии – в красный.

Методика окраски по Бурри-Гинсу.Некоторые виды бактерий продуцируют слизистое вещество, которое концентрируясь вокруг тела микробной клетки, образует капсулу. Данная окраска служит для выявления у бактерий капсул.

1. На середину предметного стекла наносят капельку туши и смешивают ее петлей с каплей культуры.

2. Делают мазок ребром покровного стекла, дают высохнуть и фиксируют над пламенем горелки.

3. Затем промывают дистиллированной водой и красят 5-10 мин фуксином.

4. Затем вновь мазок промывают водой и высушивают. При микроскопии бактерии окрашиваются в красный цвет, фон черный, а капсулы неокрашенные.

Методика окраски по Ожешко.Этот метод служит для выявления у бактерий спор. Споры имеют вид круглых или овальной формы образований, находящихся в теле микробной клетки. Различают три вида расположения спор по отношению к длинной оси палочки: центральное – спора находится в центре тела микроба, субтерминальное – спора расположена ближе к одному из ее концов, терминальное – спора располагается на конце палочки.

1. На высушенный нефиксированный мазок наливают 0,5% раствор хлористоводородной кислоты и подогревают 1-2мин над пламенем горелки до закипания.

2. Остывший препарат промывают водой, высушивают и фиксируют над пламенем спиртовки.

3. Затем на мазок наносят раствор фуксина Циля и нагревают над пламенем спиртовки до отхождения паров.

4. После того как препарат остынет, обесцвечивают его 5% раствором серной кислоты, промывают водой и докрашивают метиленовым синим в течении 3-5 мин, затем промывают водой и подсушивают. Споры, окрашенные фуксином имеют красный цвет, тело микробной клетки – синий цвет.

Методика окраски по Цилю-Нильсенудля кислотоустойчивых бактерий (возбудители туберкулеза и проказы). Особенностью микробов этой группы является то, что они плохо воспринимают окраску. Для того чтобы окрасить кислотоустойчивые микроорганизмы, приходится применять более концентрированные растворы красителя в подогретом состоянии с протравами и удлиненным сроком окраски.

1. Фиксированный над пламенем спиртовки мазок окрашивают в течение 3-5мин фуксином Циля с подогреванием до появления паров.

2. Дают препарату остыть, промывают водой.

3. Обесцвечивают в течение 3-5 с в 5% растворе серной кислоты.

4. Препарат промывают водой.

5. окрашивают метиленовым синим в течение 3-5 мин.

6. Промывают водой, подсушивают и микроскопируют.

При окраске препаратов по методу Циля-Нильсена кислотоустойчивые бактерии окрашиваются фуксином в рубиново- красный цвет и не обесцвечиваются кислотой. Некислотоустойчивые бактерии, а также элементы ткани и лейкоциты под действием кислоты становятся бесцветными и приобретают цвет дополнительного красителя (синий).

Тесты по теме:

1. Метод окрашивания для выявления капсул:

г) Цилю- Нильсену

2. Метод окрашивания для выявления спор:

г) Цилю- Нильсену

3. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются по методу:

г) Цилю- Нильсену

4. Дифференциально-диагностическая окраска бактерий:

г) Цилю- Нильсену

5. Перечислить грамположительные бактерии:

а) стафилококки, клостридии

б) кишечная палочка, сальмонелла

в) стрептококки, гонококки

6. Перечислить грамотрицательные бактерии:

а) менингококки, гонококки

б) кишечная палочка, стафилококки

в) стрептококки, сальмонеллы

7. Перечислить спорообразующие бактерии:

а) сибирская язва, клостридии

б) пневмококки, стрептококки

в) клебсиелла, стафилококки

8. Перечислить капсулообразующие бактерии:

а) пневмококки, клебсиелла

б) сибирская язва, стрептококки

в) шигеллы, сальмонеллы

Дата добавления: 2014-11-10 ; просмотров: 4128 . Нарушение авторских прав

Метод Романовского-Гимзы;

Воспрос 12. Ультраструктура бактериальной клетки. Рибосомы: строение рибосом у прокариот, функции. Отличия в строении рибосом эукариотических клеток. Цитоплазматические включения у бактерий: химическая природа, функции, способы выявления, значение.

Воспрос 11. Ультраструктура бактериальной клетки. Строение цитоплазматической мембраны, функции, методы выявления. Особенности строения наружной мембраны грамотрицательных бактерий.

Воспрос 10. Споры бактерий: типы расположения спор в клетке, строение споры. Причины устойчивости спор к воздействию факторов внешней среды. Методы выявления спор. Примеры спорообразующих бактерий.

Метод выявления капсул : метод Бурри-Гинса

Воспрос 8. Капсула бактерий: химическая природа, строение, функции, значение. Методы выявления капсул. Примеры инкапсулированных бактерий.

Капсула бактерий располагается поверх клеточной стенки. Она защищает бактериальную клетку во внешней среде от механического повреждения, высыхания, ядовитых веществ, бактериофагов, фагоцитов(в инфицированном организме ). Выявление: в мазках-отпечатках из органов зараженных животных(простой метод, метод Грама). Тела бактерий окрашены на фоне окрасившейся ткани органа,окружены белым ореолом капсулы( капсула не окрашивается). Метод Бурри-Гинса(для окраски чистой культуры капсульных бактерий).

Цель метода: выявление капсулы у бактерий

1.в каплю туши добавить каплю жидкости с микроорганизмами и растереть тонким слоем как мазок крови

2.высушить и зафиксировать в пламени горелки

3.окрасить карболовым фуксином 1мин

Сущность метода: капсула не окрашивается, задерживает тушь на поверхности, а фуксин окрашивает бактериальную клетку

Пример инкапсулированных бактерий : Klebsiella pneumoniae , Bacillus cereus

Воспрос 9. Жгутики у бактерий: строение, типы расположения, функции, способы выявления. Ворсинки: фимбрии, пили, подразделение, строение, функции. Примеры бактерий.

Жгутики являются органами движениями, представляют собой нитевидные придатки,состоят из белка флагеллина; прикрепляется к бакт.клетке с помощью базального тельца(система дисков и крючка, к которому прикреплена жгутиковая нить). Монотрихи(один жгутик),перитрихи(жгутики по всей поверхности бакт клетки), лофотрихи (пучок жгутиков на одном конце клетки), амфитрихи (единичные жгутики или пучки на разных полюсах клетки). Способы выявления: метод серебрения(жгутики искусственно утолщаются и становятся видимыми в иммерсионном микроскопе); наличие жгутиков определяется по активной подвижности микробных клеток.

Ворсинки(фимбрии и пили) состоят из белка пилина, видны только в электронном микросопе(тонкие и короткие). F-пили(половые, обеспечивают конъюгацию междубактериями);фимбрии общего порядка( адгезия).

Примеры бактерий: Половые пили Е. соli

Salmonella Typhi — перитрихи

Vibrio cholerae — монотрихи

Campylobacter jejuni — лофотрихи или амфитрихи

Эндоспора- являются приспособлением бактерий для сохранения вида в неблагоприятных условиях внешней среды. В одной бактериальной клетке образуется только одна спора! Такой способностью обладают бактерии рода Bacillus и Clostridium. (Bacillus – центральное расположение спор, не превышают поперечник клетки; Clostridium-крупные споры, субтерминально/терминально,в месте нахождения споры клетка раздувается, приобретая веретенообразную форму ).Высокая резистентность,причины: низкое содержание свободной воды, высокое содержание кальция,наличие дипиколиновой кислоты и белка, богатого цистеином,наличие нескольких оболочек). Окрашивание спор-метод Ожешки.( на высушенный мазок наложить фильтовальную бумажку, налить 0,5% раствор соляной кислоты и нагревать над пламенем спиртовки до появления пара 3 раза;далее окрашивать по Цилю- Нильсену.(Вегетативные клетки в готовом мазке-голубого цвета,споры-рубиново-красные).

ЦМП-основной барьер,который ограничивает протопласт бактерий,выявляется только в электронном микроскопе;состоит из двойного слоя фосфолипидов,куда включены интегральные и неинтегральные белки;от мембраны эукариот отличается отсутствием стеролов.

Функции: участвует в процессах избирательного активного транспорта молекул из внешней среды, является осмотическим барьером и осмотическим мостиком, выделяет гидролитические ферменты, в ее состав входят ферменты электрнонно-транспортной цепи,с ней связана АТФ-аза, содержит ферменты комплекса репликации ДНК нуклеоида,в ней фиксируются жгутики и ворсинки,имеет ферментный аппарат,участвующий в синтезе своих собственных структур, клеточной стенки.

Мезосомы— инвагинации ЦПМ внутрь клетки. Играют роль в репликации хромосомы и ее последующем расхождении по дочерним клеткам, разграничивает внутреннее содержимое на отсеки. Мезосомы грамотрицательных бактерий-простые инвагинации, грамположительных имеют сложную морфологию (везикулярные,трубчатые,пластинчатые).

Наружная мембрана грамотрицательных бактерий связана посредством липопротеина с подлежащим тонким слоем пептидогликана; внутренний компонент-фосфолипидный бислой, в наружном расположен липополисахарид (является О-антигеном, состоит из: липида А-консервативная структура; ядра, или стержневой, коровой части-олигосахаридная структура; высоковариабельного О-специфического олигосахарида). Белки- порины пронизывают мембрану, образуя гидрофильные поры, также являются рецепторами для бактериофагов.(из учебника)

Рибосомы прокариот имеют константу седиментации 70 S. Они построены из двух частиц: 30 S (малая субъединица) и 50 S (большая субъединица). S — это коэффициент седиментации, который характеризует скорость перемещения молекул или частиц в центробежном поле при центрифугировании. Рибосомы рассеяны по всей цитоплазме

В клетке эукариот имеют 80S рибосомы прикреплены к эндоплазматическому ретикулуму. Функция : синтез белков

Включения- зерна волютина,содержащие поли- и мета-фосфаты. (Corynebacterium diphtheria). Окрашиваются простым методом Леффлера( окраска фиксированного в пламени горелки мазка щелочным мителеновым синим 5 мин. Тела бактерий-голубые,зерна волютина- темно-синие) и сложным методом Нейссера (фиксированный в пламени горелки мазок окрашивают уксусно-кислой синькой в течении 1 минуты,промывают водой,протравливают раствором Люголя 30 скекунд и докрашивают везувином . Препарат промывают водой, высушивают, микроскопируют. Тела бактерий-желтые, зерна волютина- темно-синий цвет, расположены на обоих концах клетки) .

Воспрос 13. Ультраструктура бактериальной клетки. Нуклеоид бактерий: строение, функции и методы выявления. Особенности организации генетического аппарата прокариот и эукариот.

Нуклеоид у прокариот— генетический аппарат бактерий не имеет ядерной оболочки и представлен одной кольцевой двунитевой суперспирализованной молекулой ДНК,которая является хромосомой; располагается в цитоплазме,не содержит белков гистонов. Не способен к митозу

Генетический аппарат всех эукариотнаходится в ядре и защищён ядерной оболочкой.ДНК эукариот линейная. Хромосомы как структуры. Содержит белки-гистоны. Способен к митозу

Выявляют при электронной микроскопии, Романовского- Гимзы.

Цель метода: выявление нуклеоида; нуклеоид — сине-фиолетовый ; цитоплазма — розовая

Сущность метода: Амур и метиленовый синий окрашивает участки клетки со слабощелочным pH , эозин с кислым

1.провести кислотный гидролиз в растворе соляной кислоты при нагревании

3.окрашивать краской Романовского-Гимзы 40-60 мин

14. Актиномицеты: морфология чистой культуры и структура друзы актиномицетов. Методы изучения. Роль в инфекционной патологии человека.

Актиномицеты— группа нитчатых грамположительных прокариот. Виды актиномицет представляют собой тонкие неспорообразующие полиморфные палочки и нити(гифы) с ветвлением ; гифы переплетаясь , образуют мицелий.

Актиномицет у здорового человека обитают в полости рта и кишечном тракте, не причиняя ему вреда, но снижение иммунитета организма может вызвать заболевание — актиномикоз (развиваются гнойные хронические процессы с поражением любых органов и тканей).

В пораженном организме актиномицеты образуют друзы , имеющие звездчатую, лучистую форму. Центр друзы состоит из компактного кальцинированного плотного мицелия, а периферийные гифы покрыты капсулоподобными эозинофильными чехлами, выполняющими защитную функцию.

Для изучения актиномицет применяют методы Грама и Циля-Нильсена

15. Микоплазмы: таксономия, строение клетки, особенности морфологии, биологические свойства, методы культивирования и выявления. Роль в инфекционной патологии человека.