Методы окраски спор микроорганизмов

Споры имеют высокий показатель преломления из-за низкого содержания воды. Поэтому они хорошо видны на фоне вегетативных клеток при микроскопическом исследовании. Существуют различные способы окраски спор микроорганизмов. Все они основаны на протравливании кислотами или щелочами споровой оболочки, которая разрыхляется и облегчает проникновение краски. Наиболее распространенными являются методы Ожешко, Пешкова и Циля.

Метод Ожешко. Препарат высушивают на воздухе и, не фиксируя, протравливают 0,5% соляной кислотой при осторожном нагревании. Для этого предметное стекло с одного конца берут пинцетом и подогревают до появления пара (не допускать кипения!) в течение 2-3 минут. Затем препарат охлаждают, осторожно промывают водой, подсушивают и фиксируют над пламенем горелки. На фиксированный препарат кладут листок фильтровальной бумаги размером 10×10 мм, наливают на него карболовый фуксин Циля (рец. 10) и осторожно подогревают до паров (не допускать кипения!) в течение 7-8 минут, В течение этого времени следят за наличием краски на препарате и по мере испарения осторожно по каплям добавляют ее, не допуская высыхания. После прогревания ли­сток фильтровальной бумаги снимают пинцетом, сливают остатки краски, препарат обрабатывают 5-7 секунд 5% раствором серной кислоты, тщательно промывают дистиллированной водой, докрашивают метиленовым синим Леффлера (рец. 11) или 1% раствором малахитовой зелени в течение 3-4 минут, вновь промывают дистиллированной водой и высушивают. Препарат микроскопируют под масляной иммерсией. При правильном окрашивании вегетативная часть клетки будет синяя (зеленая), а споры — красные.

Метод Пешкова. Мазок фиксируют над пламенем горелки. На фиксированный препарат кладут листок фильтровальной бумаги, наливают водно-спиртовой раствор метиленового синего (рец. 12), нагревают до кипения, смывают дистиллированной водой. Затем препарат докрашивают в течение 10-15 секунд водным раствором нейтрального красного, смывают дистиллированной водой, просушивают и микроскопируют под масляной иммер­сией. При правильном окрашивании вегетативная часть клетки окрашивается в красный цвет, а споры — в синий.

Метод Циля. Препарат высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки, протравливают 5% раствором хромовой кислотой в течение 5-10 минут и промывают дистиллированной водой. Излишки воды сливают, на препарат кладут листок фильтровальной бумаги и наливают карболовый фуксин Циля. Предметное стекло берут пинцетом и подогревают до появления пара (не допускать кипения!). Затем препарат промывают дистиллированной водой, обес­цвечивают в течение 10-15 минут 1% раствором серной кислоты и быстро промывают дистиллированной водой. После этого препарат течение 15 – 20 минут докрашивают метиленовым синим, промывают дистиллированной водой и высушивают. Препарат микроскопируют под масляной иммерсией. При правильном окрашивании вегетативная часть клетки будет синяя, а споры — красные.

Для окраски спор на практических занятиях можно использовать культуры Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus, Bacillus antracoides.

Справочник химика 21

Химия и химическая технология

Окраска спор бактерий

При наблюдении за живыми спорообразующими бактериями их споры можно различить по более сильному преломлению световых лучей. Споры кислотоустойчивы, поэтому с трудом окрашиваются красителями. Объясняется это большой плотностью оболочки,- низкой концентрацией свободной воды в ней и высоким содержанием липидов в спорах. В препаратах, окрашенных простыми способами или по Граму, споры остаются бесцветными (негативная окраска). [c.31]

Обнаружение спор бактерий важно для их идентификации. Используются специальные методы окраски, основанные на более интенсивном прокрашивании этих плохо воспринимающих окраску структур. Приводим некоторые из них. [c.23]

Плотная оболочка спор, непроницаемая для воды, окрашивается с большим трудом, поэтому при обычных методах окраски споры имеют вид неокрашенных пустот внутри клетки. Для окраски спор пользуются специальными методами с применением протрав (кислоты или щелочи). Протравы разрыхляют оболочку споры, облегчая проникновение в нее красителя. Окрасившиеся споры обладают кислотоустойчи-востью в отличие от вегетативного тела микробной клетки, обесцвечивающегося под действием кислоты. Поэтому принцип окраски спор и кислотоустойчивых бактерий одинаков препарат окрашивают основным красителем, затем обесцвечивают кислотой и докрашивают дополнительно в какой-ни-будь контрастный цвет. [c.33]

ОКРАСКА СПОР БАКТЕРИИ [c.71]

Мюллер, модифицировав известный метод Циля — Нильсена, применяемый обычно для выявления кисло тоустойчивости бактерий (дифференциальной окраски микобактерий и некоторых близких к ним микроорганизмов), связанной с особенностями химического состава их оболочки, предложил использовать его для окраски спор бактерий. [c.44]

Обнаружение капсул бактерий имеет значение как для их дифференциации, таки для определения их вирулентности. Капсулы, как и споры, плохо воспринимают анилиновые красители, поэтому чаще применяют негативные методы окраски. [c.22]

ОКРАСКА СПОР У БАКТЕРИЙ [c.43]

Различают простые и сложные способы окраски. Первые основаны на применении какой-либо одной краски, например метиленового синего или фуксина. Вторые предусматривают воздействие на один и тот же препарат двух красок. Сложные методы окраски позволяют обнаруживать в теле микробной клетки различные структурные элементы (капсулы, споры, включения), помогают дифференцировать сходные по величине и форме бактерии, принадлежащие к различным видам. [c.25]

Окраска спор у бактерий. Споры бактерий по сравнению с вегетативными клетками обладают высокой устойчивостью к неблагоприятным условиям внешней среды. Они представляют собой округлые, овальные или эллипсовидные образования. Если диаметр споры не превышает диаметра клетки, в которой образуется спора, клетку называют бациллярной, если превышает, то в зависимости от расположения споры в центре или на конце клетки соответственно клостриди-альной или плектридиальной. В бациллярной клетке спора может размещаться в центре клетки — центральное положение, на конце — терминальное и ближе к одному из концов — субтерминальное. [c.31]

Бактериоскопическое исследование (схема 15). Из исследуемого материала готовят мазки, окращивают по Граму и метиленовым синим. Бактерии туляремии весьма полиморфны. В чистой культуре они представляют собой очень мелкие микроорганизмы (0,3—0,5 мкм) коккобактериальной формы (рис. 77). В мазках из органов преобладают палочковидные формы. Спор не образуют, имеют небольшую капсулу, неподвижны, грамотрицательны, тогда выражена биполярная окраска. [c.203]

Большая часть микроорганизмов бесцветна. Колонии дрожжей обычно окрашены в слегка беловатые, кремоватые или сероватые тона. Дикие дрожжи иногда бывают окрашены в красные или розоватые цвета и редко в черные. Многие актиномицеты образуют различные пигменты и бывают окрашены в красные, розовые, зеленоватые и черные тона. У грибов окрашены споры, конидии и поверхностный слой гиф в черные, зеленые, желтые цвета. Окраска у микроорганизмов связана с наличием пигментов, которые являются отбросными продуктами обмена вещест клетки. Только пигменты некоторых бактерий участвуют в процессах фотосинтеза. Они бывают окрашены в желгые, красные, сине-зеленые цвета. [c.495]

Заражение личинок японского жука происходит в результате заглатывания бактерий, которые проникают сквозь стенки кишечника насекомого в вегетативной форме. После периода развития в полости тела насекомого бактерия образует споры. Кровь зараженной личинки приобретает молочно-белую окраску. Хотя спороношение обычно начинается на третий-четвертый день после заражения, число спор обычно достигает максимума примерно через 13- 16 дней. Мутность крови обычно можно обнаружить, начиная примерно с шестого дня. Если оторвать ногу больной личинки, из отверстия вытекает капля непрозрачной белой жидкости Ii отличие от прозрачной или лишь слегка мутноватой канли, вытекающей из тела здоровой личинки. [c.397]

Хранение в высушенном состоянии на адсорбентах. Этот метод применяют главным образом для актиномицетов, микроскопических грибов и анаэробных бактерий, образующих споры. В качестве адсорбентов используют почву, кварцевый песок, силикагель, вату, фильтровальную бумагу. Разработанной стандартной техники этот способ не имеет. В самом общем виде он сводится к тому, что стерильный адсорбент, помещенный в ампулы, смешивают с густой суспензией клеток и высушивают под вакуумом или при комнатной температуре. Затем ампулы запаивают и хранят при комнатной температуре или в холодильнике. Имеются данные, что у актиномицетов после хранения в почве или в кварцевом песке восстанавливаются некоторые таксономические признаки (окраска воздушного и субстратного мицелия), которые были утрачены в процессе длительного культивирования в лаборатории. [c.70]

Смотреть страницы где упоминается термин Окраска спор бактерий: [c.351] [c.494] [c.268] [c.252] [c.53] Смотреть главы в:

Окраска спор у бактерий;

Вводные пояснения. Споры бактерий по сравнению с вегетативными клетками обладают высокой устойчивостью к неблагоприятным условиям внешней среды. Они представляют собой округлые, овальные или эллипсовидные образования. Если диаметр споры не превышает диаметра клетки, в которой спора образуется, клетку называют бациллярной, если превышает, то в зависимости от расположения споры в центре или на конце клетки эту клетку называют соответственно клостридиальной или плектридиальной.. В бациллярной клетке спора может размешаться в центре клетки — центральное положение, на конце — терминальное и ближе к одному из концов — субтерминальное положение.

При наблюдении за живыми спорообразующими бактериями их споры можно различить по более сильному преломлению световых лучей. Споры кислотоустойчивы, поэтому с трудом окрашиваются красителями. Объясняется это большой плотностью оболочки, низкой концентрацией в ней свободной воды и высоким содержанием липидов в спорах. В препаратах, окрашенных простыми способами или по Граму, споры остаются бесцветными (негативная окраска).

В связи с особенностями физико-химического состава и плотной малопроницаемой оболочкой на первом этапе окраски спор применяют химические вещества, изменяющие структуру их оболочки. Однако при последующем прокрашивании споры одновременно прокрашивается и цитоплазма клетки, поэтому под микроскопом последняя выглядит однородно окрашенной. Для того чтобы на препарате оставались прокрашенными только споры, следует такой «перекрашенный» препарат частично обесцветить, забирая краситель у цитоплазмы и оставляя его в споре. Этого достигнуть нетрудно, так как краситель, адсорбированный спорой, удерживается прочнее, чем поглощенный цитоплазмой клетки.

Таким образом, все способы окраски спор основаны на едином принципе: сначала споры протравливают различными веществами: хромовой, соляной, серной, уксусной кислотами, аммиаком, едким натром или перекисью водорода, затем окрашивают клетку со спорой при нагревании и, наконец, обесцвечивают цитоплазму и дополнительно окрашивают ее контрастным красителем.

Метод Циля—Нильсена в модификации Мюллера. Мюллер, модифицировав известный метод Циля—Нильсена, применяемый обычно для выявления кислотоустойчивости бактерий (дифференциальной окраски микобактерий и некоторых близких к ним микроорганизмов), снизанной с особенностями химического состава их оболочки, предложил использовать его для окраски спор бактерий.

До фиксации мажа бактерий на пламени препарат готовят обычным способом (см. 2.2.1). Далее на фиксированный в пламени и остывший препарат наносят 5%-ный раствор хромовой кислоты. Через 5—10 мин ее смывают водой. Препарат накрывают полоской фильтровальной бумаги и обильно смачивают бумагу карболовым фуксином Циля. Подогревают препарат над пламенем до появления паров (не до кипения), затем отводят его в сторону и добавляют новую порцию красителя. Эту процедуру проводят в течение 7 мин. Важно, чтобы краситель испарялся, но бумага не подсыхала. После охлаждения ее снимают, препарат промывают водой и тщательно промокают фильтровальной бумагой. В результате такой обработки клетки со спорами равномерно прокрашиваются.

Далее обесцвечивают цитоплазму клеток (но не споры), обрабатывая 1%-ным раствором соляной или серной кислот в течение 15—30 с. При приготовлении препарата спор Bacillus mycoides или Bacillus mesentericus рекомендуется обесцвечивать цитоплазму 16—18 с (размеренно считая вслух от 21 до 37—40). При превышении этого времени могут обесцветиться и споры. Затем препарат промывают водой и окрашивают метиленовым синим 2 мин.

Если все операции проделаны правильно, окраска получается контрастной и ярко-красные споры четко выделяются на голубом фоне цитоплазмы.

Метод Пешкова. На фиксированный в пламени препарат наливают метиленовый синий Леффлера, доводят его до кипения и кипятят 15—20 с, держа стекло над пламенем. Мазок промывают водой и докрашивают в течение 30 с 0,5%-ным водным раствором нейтрального красного. Еще раз промывают, подсушивают и далее исследуют препарат с масляной иммерсией объектива. Споры окрашиваются в голубой или синий цвета, цитоплазма — в розовый.

Для исследования спор удобными объектами могут служить Bacillus mesentericus или Bacillus mycoides в возрасте 4 сут.

Реактивы для окрашивания спор бактерий.

1. Карболовый фуксин Циля (см. 3.2.2).

2. Метиленовый синий Леффлера (см. 3.2.2).

3. Насыщенный водный раствор метиленового синего 2 г красителя и 100 мл дистиллированной воды.

4. Хромовая кислота, 5%-ный раствор.

5. Соляная (или серная) кислота, 1%-ный раствор.

Нарисуем невидимое, или Методы окраски микроорганизмов

Мы живем в мире бактерий. Они вокруг нас и внутри нашего организма. Не удивительно, что мы хотим знать о них как можно больше. Но как рассмотреть и тем более изучить что-то настолько маленькое? Микроскоп, казалось бы, должен решить эту проблему. Но не все так просто – в своем естественном состоянии микроорганизмы прозрачны как стекло. «Проявить» картинку помогают различные методы окраски бактерий, помогающие исследовать внешнее и внутреннее строение микробов.

Как все начиналось

В конце девятнадцатого века датский биолог Кристиан Грам предложил решение этой проблемы. Если что-то невидимо, его нужно покрасить и посмотреть, что получится. Метод окраски бактерий, предложенный Грамом, был настолько убедителен, что и по сей день микроорганизмы разделяют на грамположительные (удерживающие окраску) и грамотрицательные (обесцвечивающиеся после обработки спиртом).

Как оказалось, клетки покрыты оболочкой, похожей на переплетенные между собой нити. И хотя в просветы между нитями свободно проходят питательные вещества, необходимые клетке, оболочка надежно защищает «внутренний мир» от внешних агрессивных факторов. У разных видов бактерий наружная стенка клетки имеет различную толщину, плотность и химический состав. Именно на этом свойстве клеточных оболочек базируется метод окраски по Граму.

Отталкиваясь от работ Кристиана Грама, биологи разработали новые методы, позволяющие не только определить форму и размер клеток, но и рассмотреть некоторые подробности их строения. Иногда микроорганизмы, совершенно идентичные по внешнему виду, по-разному реагируют на красители. Полученная информация дает возможность быстро и точно определить вид бактерий.

Старый – не значит плохой

Пожалуй, самый практичный и широко применяемый способ окрашивания микроорганизмов – метод Грама. Мазок, зафиксированный огнем, покрывают метиловым фиолетовым красителем, фиксируют йодом, просушивают и промывают спиртом. На этом этапе, в зависимости от свойств клеточной мембраны, бактерии становятся:

• ярко-синими (грамположительные);
• бесцветными (грамотрицательные).

Толщина оболочки клеток, оставшихся бесцветными, не позволяет краске проникнуть внутрь, и она легко смывается с поверхности бактерий. Последним шагом окрашивания по Граму является использование красного красителя, он остается на поверхности клеточной мембраны и придает ей розовый или красный оттенок.

Грамположительные бактерии, как правило, опасны для человека. К этой категории относятся стрептококки, стафилококки, бациллы, клостридии и т. д. Грамотрицательные не настолько опасны. Они тоже могут вызывать болезни и воспаления, но только при определенных условиях. Таким образом, просто приготовив окрашенный препарат, можно получить представление о степени опасности исследуемых микроорганизмов.

Витальные методы окраски

По состоянию исследуемых организмов в микробиологии существуют:

• витальный способ, т. е. работа с живыми бактериями (опасен, требует строгого соблюдения техники безопасности);
• поствитальный метод – работа с фиксированными (убитыми) клетками;
• негативный, может быть витальным и поствитальным, удобен для работы с капсулами.

Витальный метод, безусловно, самый опасный, так как исследователям приходится иметь дело с живыми клетками, иногда представляющими смертельную опасность. Однако именно такой способ дает возможность изучать не только строение клетки, но и весь ее жизненный цикл и взаимодействие с окружением.

Для многих микробиологических исследований важно сохранить бактерии живыми. Это значит, что нужно использовать специальные нетоксичные или низкотоксичные красители, к тому же легко проникающие в структуру клетки через наружную оболочку. Это так называемые витальные красители, они могут быть предназначены для видимого света или флуоресцентными. По химическому составу красители разделяются на:

• основные (акридиновый оранжевый, метиленовый синий);
• кислотные или кислые (индигокармин, кислый фуксин);
• нейтральные (родамин В).

Работа с фиксированными препаратами

По сложности работы методы окраски фиксированных (неживых) клеток разделяются на:

1. Простые методы. В этом случае используют только одну краску, как правило, красную (фуксин) или синюю (метиленовый синий). Разница между этими красителями состоит в скорости воздействия. Фуксин дает результат уже через 1-2 мин., тогда как результат работы синей краски нужно ждать 3-5 мин. Использовать раствор фуксина в карболовой кислоте (т. н. фуксин Циля) удобно еще и потому, что приготовленный препарат в течение нескольких месяцев не теряет окрашивающих свойств. Метиленовый синий краситель тоже может быть подготовлен заранее в крепком спиртовом растворе.
2. Сложные (дифференциальные) методы. Здесь потребуется несколько красителей (минимум два), имеющих различный цвет. Это позволит не просто увидеть бактерии, но и подробнее изучить их внутреннее строение, так как различные участки клетки могут по-разному воспринимать красители. К сложным относят методы Грама, Циля – Нильсена (для кислотоустойчивых бактерий), Бениньетти (окраска бактериальных жгутиков), Гинса (выявление капсул), дифференцирующий метод Романовского – Гимзы (окраска спор) и некоторые другие.

Особенно важны сложные методы для диагностики инфекционных заболеваний, например, способ окраски Нейссера помогает отличить дифтерийную палочку от ложнодифтерийных.

Дифференцирующий способ Романовского – Гимзы основан на применении специального готового порошка, на основе которого лаборатории готовят раствор красителя нужной концентрации. Преимущество этого способа в том, что цитоплазма и ядро клетки получают различную окраску, что облегчает идентификацию и изучение микроорганизмов.

Метод Нейссера используют в медицине для обнаружения зерен волютина (гранул с запасом пищи для многих прокариотических клеток) у возбудителей дифтерии. В результате окрашивания бактерия приобретает желтый цвет, а гранулы волютина – синий.

Белым по черному

Еще одна разновидность окраски бактерий основана на свойствах негатива, т. е. на темном фоне препарата четко видны бесцветные бактерии, иными словами, окрашивается среда, а не сам организм.

Иногда бактерии, попадая в определенные условия, образуют капсулы. Это слизистые образования, покрывающие клетку, чем-то похожие на гель. Капсулы прозрачны, их химический состав может сильно отличаться у разных видов бактерий, т.е. просто покрасить и оценить результат по получившемуся цвету не выйдет.

Кроме того, капсулы мягкие и непрочные, при окраске они могут потерять форму. Красящие вещества плохо взаимодействуют с желеобразной структурой капсул и легко вымываются при обработке. Чтобы обнаружить, но не повредить капсулы, пригодится негативный способ окрашивания.

Одним из способов выявления капсул является метод окрашивания по Гинсу. Каплю черной туши наносят на край предметного стекла, вносят в нее исследуемый материал, перемешивают и распределяют по всей поверхности. Мазок сушат на воздухе, фиксируют и окрашивают фуксином Циля. Через 2-3 минуты промывают водой и высушивают. В результате под микроскопом на общем темном фоне отчетливо просматриваются розовые клетки, окруженные прозрачными капсулами.

Окраска спорообразующих бактерий

Если говорить о клеточных оболочках, то нельзя не вспомнить о спорообразующих бактериях. Споры образуются при неблагоприятных для клетки условиях и могут существовать в агрессивной среде довольно длительное время. То, что хорошо для сохранения клетки, плохо для ее изучения. Споры очень плотные и почти не пропускают жидкости, кроме того, они кислотоустойчивы. Следовательно, простое окрашивание или метод Грама оставят споры бесцветными.

Перед началом окрашивания приходится химически обрабатывать поверхность спор, чтобы она немного изменила свою структуру и позволила красящим веществам проникнуть внутрь. При этом окрашивается и вся цитоплазма клетки. Чтобы обесцветить цитоплазму, препарат промывают и высушивают. Краска в спорах, благодаря их более плотной структуре задерживается лучше, чем в цитоплазме.

Способы окраски спор могут быть разными, например, Ожешко или Циля – Нильсена, но все они сводятся к одной схеме:

• разрыхление поверхности спор химическими веществами (кислоты, аммиак, едкий натр);
• окрашивание клетки со спорой (обычно при нагревании);
• обесцвечивание цитоплазмы.

В результате получаем отлично видимую ярко окрашенную спору и бледную, почти прозрачную цитоплазму.

Как рассмотреть бактериальные жгутики

Еще одна непростая задача – окраска бактерий со жгутиками. Это спирально закрученные очень тонкие нити, которые микроорганизмы используют для перемещения. Жгутики необычайно тонкие, при окрашивании они легко отрываются от клетки. Поэтому перед началом окрашивания жгутики протравливают, искусственно увеличивая в объеме.

При подготовке микроорганизмов к исследованию бактериальную культуру несколько раз пересеивают на свежую питательную среду в течение нескольких дней. Затем бактерии со жгутиками переносят в пробирку со стерильной водой (t 37⁰С). Делают это предельно осторожно, не перемешивая жидкость, чтобы не повредить жгутики.

Содержимое пробирки оставляют примерно на час, чтобы бактерии равномерно распределились по всему объему. Перед началом исследования проверяют подвижность клеток в висячей капле. Если движения нет, пробирку оставляют еще на некоторое время.

При нанесении раствора на предметное стекло клетки могут легко потерять жгутики. Поэтому поверхность стекла должна быть идеально чистой и обезжиренной. Перед нанесением капель раствора предметное стекло проводят над горячей частью пламени горелки, чтобы попавшие на поверхность капли расплылись и быстро высохли.

После высыхания мазок протравливают, через 15 минут химикат смывают. Следующий этап – окраску фуксином – проводят, погружая стекло в раствор красителя, чтобы не повредить жгутики при нанесении краски.

Выдержав нужное время, мазок промывают водой и высушивают. Теперь можно переходить к исследованию получившегося результата.

Техника окрашивания

Для получения окрашенного препарата нельзя просто взять кисточку, краски и отловить бактерию. Существует определенная схема работы с микроорганизмами:

1. Приготовление мазка. На предметное стекло (стерильное) наносят каплю воды, в которую затем бактериологической петлей вносят и распределяют по поверхности лабораторный материал.
2. Высушивание. Лишняя жидкость высушивается либо естественным путем при комнатной температуре, либо мазок немного прогревается высоко над пламенем горелки.
3. Фиксация. Мало просто убрать воду, нужно закрепить бактерии на предметном стекле. Для этого можно использовать огонь (несколько проходов над самой горячей частью пламени) или жидкость (спирт, ацетон). После такой обработки микроорганизмы быстрее впитывают краску.
4. Непосредственно окрашивание. Краска должна полностью покрывать всю поверхность мазка. Выдержав нужное время (для каждого красителя свое), краску убирают и промывают препарат водой.

После высыхания (обычно естественным путем) полученный результат можно использовать по назначению.

Окрашивание микроорганизмов – это целая система методов, приемов, схем, направленных на обнаружение и распознавание клеток при помощи микроскопа. Ни одно медицинское исследование или научная работа в микробиологии не обходятся без предварительной подготовки и окраски изучаемого материала.

Методы окраски бактерий (мазков)

Окраску мазка производят простыми или сложными методами. Простые заключаются в окраске препарата одним красителем; сложные методы (по Граму, Цилю-Нильсену и др.) включают последовательное использование нескольких красителей и имеют дифференциально-диагностическое значение. Отношение микроорганизмов к красителям расценивают как тинкториальные свойства. Существуют специальные методы окраски, которые используют для выявления жгутиков, клеточной стенки, нуклеоида и разных цитоплазматических включений.

При простых методах мазок окрашивают каким-либо одним красителем, используя красители анилинового ряда (основные или кислые). Если красящий ион (хромофор) — катион, то краситель обладает основными свойствами, если хромофор — анион, то краситель имеет кислые свойства. Кислые красители — эритрозин, кислый фуксин, эозин. Основные красители — генциановый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, метиленовый синий, основной фуксин. Преимущественно для окраски микроорганизмов используют основные красители, которые более интенсивно связываются кислыми компонентами клетки. Из сухих красителей, продающихся в виде порошков, готовят насыщенные спиртовые растворы, а из них — водно-спиртовые, которые и служат для окрашивания микробных клеток. Микроорганизмы окрашивают, наливая краситель на поверхность мазка на определенное время. Окраску основным фуксином ведут в течение 2 мин, метиленовым синим — 5—7 мин. Затем мазок промывают водой до тех пор, пока стекающие струи воды не станут бесцветными, высушивают осторожным промоканием фильтровальной бумагой и микроскопируют в иммерсионной системе. Если мазок правильно окрашен и промыт, то поле зрения совершенно прозрачно, а клетки интенсивно окрашены.

Сложные методы окраски применяют для изучения структуры клетки и дифференциации микроорганизмов. Окрашенные мазки микроскопируют в иммерсионной системе. Последовательно нанести на препарат определенные красители, различающиеся по химическому составу и цвету, протравы, спирты, кислоту и др.

При простых методах окраски используется лишь одна краска.

С этой целью в бактериологии используются, как правило, или водный фуксин или метиленовая синька. Простые методы окраски используются для ориентировочной, предварительной, микроскопии – определения наличия в патологическом материале бактерий, определение их формы и расположения в мазке.

При сложных методах окраски используются ряд красок в определенной последовательности. Такие методы используются для выявления в патологическом материале конкретных микроорганизмов, а также определения особенностей их ультраструктуры.

1. Окраска по Граму используется для определения типа строения клеточной стенки. Это основной метод в бактериологии. В зависимости от окраски по Грамму все бактерии подразделяются на грампо-ложительные и грамотрицательные.
2. Окраска по Цилю-Нильсену используется для выявления кислотоустойчивых бактерий (а именно – микобактерий), а также для обнаружения спор.
3. Окраска по Нейссеру используется для выявления цитоплазматических включений волютина и идентификации по их наличию коринебактерий (в частности – возбудителей дифтерии).
4. Окраска по Бури-Гинсу используется для выявления макрокапсул.
5. Окраска по Морозову используется для выявления жгутиков. Этот метод окраски используется также для выявления трепонем. Кроме того, окраску по Морозову используют в вирусологии – для выявления в оспенных пузырьках вирусов натуральной и ветряной оспы.
6. Окраска по Здрадовскому используется для выявления риккетсий и хламидий.
7. Окраска по Романовскому-Гимзе также, наряду с окраской по Здрадовскому, используется для вы-явления риккетсий и хламидий; кроме того, этот метод окраски используется для выявления спирохет (с их идентификацией до рода в зависимости от цвета окрашивания), а также для выявления простейших.

Техника окраски бактерий в гистологических срезах по Граму-Вейгерту

1. Депарафинированные срезы доводят до воды.
2. Окрашивают 20 мин в 1 % растворе парарозанилина или основного фуксина в 1 % уксусной кислоте (раствор красителя нагревают до кипения, охлаждают и фильтруют).
3. Промывают в 3 сменах дистиллированной воды.
4. Окрашивают 5 мин в 1 % кристаллического фиолетового в дистиллированной воде.
5. Быстро ополаскивают в 1 % растворе хлорида натрия.
6. Обрабатывают 30 с в смеси: 1 часть йода + 2 части йодида калия + 100 частей дистиллированной воды.
7. Промокают фильтровальной бумагой.
8. Дифференцируют, нанося на срез смесь равных объемов анилина и ксилола (1 — 2 мл); растворы сливают до тех пор, пока облачка красителя не перестанут отходить от среза.
9. Проводят через 3 смены ксилола.
10. Заключают в бальзам или любую смолу, растворенную в ксилоле.

Результат: грамположительные бактерии сине-черные, фибрин фиолетовый, ядра красные.

Окраска бактерий по по Цилю-Нильсену

Метод используется для окраски спор и кислотоустойчивых бактерий (микобактерии туберкулеза). Кислотоустойчивость связана с наличием в клеточной стенке мяколовых кислот. Метод Циль-Нильсена основан на использовании концентрированных красителей прогревания.

ЗАНЯТИЕ 4. СЛОЖНЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ МИКРООРГА­НИЗМОВ. ОКРАСКА ПО ГРАМУ

Существуют простые и сложные методы окраски, которые применяют­ся в зависимости от целей исследования.

Сложные методы окраски основаны на особенностях физико­химического строения микробной клетки.

Сложные методы окраски имеют дифференциально-диагностическое значение для характеристики изучаемого микроба. К сложным методам окра­ски относятся: окраска по методу Грама, окраска спор и т.д.

Все бактерии в зависимости от способности окрашиваться по Граму разделяются на две нетаксономические группы — грамположительные и гра- мотрицательные формы. Окраска предложена в 1884 г. датским ученым Х. Грамом и позволяет дифференцировать бактерии, принадлежащие к различ­ным видам, но сходные по форме и размерам.

При обработке мазков микроорганизмов генцианвиолетом, а затем йо­дом препарат, окрашенный в черный цвет, обладает свойством обесцвечи­ваться под действием спирта. При этом одни бактерии также обесцвечивают­ся, а другие окрашиваются в фиолетовый цвет. При дополнительной окраске (в частности, разведенным фуксином 1:10) обесцвеченные спиртом бактерии окрашиваются в красный цвет (грамотрицательные). Другие же, прочно удерживающие фиолетовую окраску (соединение йод + генцианвиолет), т. е. не обесцвечивающиеся спиртом, относятся к группе грамположительных бактерий.

Различие в окраске объясняется особенностями химического строения

бактерий и ультраструктурой клеточных стенок, которые постоянны для оп­ределенного вида. Клеточная стенка грамположительных бактерий содержит многослойный муреин со сравнительно часто расположенными сшивками. Белки грамположительных бактерий имеют более кислый характер и лучше окрашиваются основными красителями, чем у грамотрицательных бактерий. Кроме того, грамположительные бактерии содержат рибонуклеат магния, ко­торый взаимодействует с образующимся в процессе окраски комплексом и препятствует вымыванию его спиртом. На результат окрашивания оказывают влияние небольшие отклонения в условиях культивирования или в методе окраски, возраст культуры, кислотность среды (в кислой среде, как правило, все бактерии грамотрицательны).

Окраска по Граму производится следующим образом:

1. Приготовить на предметном стекле три мазка из бактериальных культур: заведомо известной грамположительной, исследуемой и заведомо известной грамотрицательной.

2. Все мазки одновременно высушить.

3. Зафиксировать мазки в пламени спиртовки.

4. Окрасить 1%-м раствором генцианового фиолетового в течение 1 минуты.

5. Краситель слить и, не промывая мазки, залить их раствором Люголя на 1-2 минуты.

6. Промыть препарат обильно водой.

7. Одновременно погрузить все три мазка в стакан с 96 % этиловым спиртом.

8. Обесцвечивание считается законченным, когда стекающие с мазка капли спирта сравняются по цвету со спиртом в стакане; обычно для этого требуется 10-30 секунд, в зависимости от толщины мазка.

9. Промыть препараты водой (при микроскопировании таких препара­тов грамотрицательные бактерии бесцветны).

10. Окрасить препараты фуксином течение 1 минуты.

11. Препараты высушить и микроскопировать.

Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, гра- мотрицательные — в розовый.

При окраске по Граму необходимо точно соблюдать указанные сроки. Модификацией окраски по Граму является способ Синева, при котором вме­сто жидкой краски генцианового фиолетового используют полоски фильтро­вальной бумаги, заранее пропитанные этой краской и высушенные. На фик­сированный мазок наносят 2-3 капли воды, на них помещают полоски окра­шенной фильтровальной бумаги. Остальные этапы окраски аналогичны клас­сическому методу Грама.

Для определения принадлежности бактерий к таксономической группе используют также экспресс-метод Грезерсона (1979). На предметном стекле в капле 3%-го раствора КОН готовится суспензия изучаемой культуры. При этом грамположительные бактерии коагулируют, а грамотрицательные обра­зуют вязкую тянущуюся массу.

Выяснить отношение к окраске по Граму исследуемых культур мето­дами Грама и Грезерсона.

План выполнения работы

1. Приготовить смешанную суспензию культур и окрасить методом Грама.

2. Выяснить принадлежность данных культур к группе грамположи- тельных или грамотрицательных бактерий методом Грезерсона.

3. Сделать зарисовки.

Вопросы для самостоятельного контроля

1. Какие методы окраски микроорганизмов называют сложными? Для чего они используются?

2. В чем сущность метода окрашивания бактерий по Граму?

3. Почему бактерии окрашиваются по-разному методом Грама?

4. Какие факторы оказывают влияние на результат окрашивания по Граму?

5. Какова последовательность действий при окрашивании бактерий ме­тодом Грама?

6. Какие существуют модификации метода окрашивания по Граму?

7. В чем отличия грамположительных и грамотрицательных бактерий?

8. Какой компонент клеточной стенки является обязательным для грамположительных и грамотрицательных бактерий?

9. В чем сущность экспресс-метода Грезерсона?

Окрашивание спор бактерий

Жгутики бактерий очень тонки и легко отрываются. Поэтому обнаружить их можно только при специальной окраске или с помощью электронного микроскопа.

Выявить жгутики у бактерий, применив обычные способы окраски анилиновыми красителями невозможно.

Жгутики, как правило, становятся видимы, если препарат предварительно обработать протравой, а потом окрасить. Протравленный препарат легче воспринимает окраску, но самое главное то, что жгутики при осаждении на них протравы увеличиваются и становятся видимыми при микроскопировании.

Существуют разные способы окраски жгутиков, но в каждом отдельном случае в зависимости от индивидуальных свойств микробов приходится выбирать тот или иной способ.

Для успешной окраски жгутиков должны соблюдаться следующие условия:
1. Чистота предметных и покровных стекол должна быть идеальной.
2. Препарат должен готовиться из свежей агаровой суспензии культуры не старше суточной, а для некоторых видов (вибрион, сенная палочка) не старше 12 часов. Часть материала, взятую из посевной черты (ближе к конденсационной воде), где больше влаги переносят в пробирку с 1 – 2 мл стерильной водопроводной воды. Пробирки выдерживают 30 60 минут при комнатной температуре, затем взвесь бактерий переносится в каплю стерильной водопроводной воды или физиологического раствора, нанесенную на покровное стекло. При распределении материала на покровном стеклышке, надо соблюдать осторожность, чтобы механически не повредить жгутики инее оторвать их от тела бактерий.

Мазок должен быть тонким, чтобы особи могли расположиться изолировано друг от друга.

Воду на стекле следует распределять тонким слоем, чтобы ускорить высыхание препарата и уменьшить потерю жгутиков.

Наиболее часто для окрашивания жгутиков используют способ Леффлера (Loffler). Методика окраски:
1. На высушенный и зафиксированный мазок наливают протраву в таком количестве, чтобы покрыть всю поверхность покровного стеклышка, и выдерживают 3 – 5 минут при комнатной температуре.
2. По истечении указанного времени препарат осторожно и тщательно промывают проточной водой.
3. На препарат наносят раствор фуксина (1 часть насыщенного спиртового раствора фуксина на 10 частей воды) и препарат прогревают над пламенем до появления пара.
4. Препарат промывают водой и микроскопируют.

Приготовление протравы для выявления жгутиков бактерий:
12г танина растворяют при нагревании в 48 мл воды и к этому раствору прибавляют 30 мл насыщенного раствора фуксина в 95% этиловом спирте. Раствор отфильтровывают и хранят в стеклянной емкости с притертой пробкой. Протрава готова к употреблению через несколько дней после приготовления и может сохраняться в течение нескольких месяцев.

Для обнаружения жгутиков у простейших препараты можно окрашивать простым способом, используя метиловый синий, раствор Люголя или сложным методом по Романовскому – Гимза.

Выявление капсул у бактерий

Капсулы не обладают выраженным сродством к основным красителям, поэтому для обнаружения капсул применяют различные способы приготовления микропрепаратов и их окраски, учитывая особенности образования и сохранения капсул у разных видов бактерий.

Для обнаружения капсулы необходимо наличие окрашенного внутри капсулы фона и окрашенного наружного фона.

Внутренний фон представлен окрашенной микробной клеткой, находящейся внутри капсулы. А наружный фон, окружающий капсулу, может быть естественным или искусственным.

Если микроб сохраняет капсулу постоянно, т.е. не только внутри макроорганизма, но и на питательной среде (клебсиеллы), то препарат для обнаружения капсул можно приготовить из культуры, выращенной in vitro на питательной среде. И в таком случае наружный фон создается искусственно.

Если микроб образует и сохраняет капсулу только внутри макроорганизма (возбудители сибирской язвы, чумы, пневмококки), то в таком случае делается мазок – отпечаток из пораженного органа погибшего макроорганизма (из печени, селезенки, лимфатических узлов) или из мокроты, содержимого бубона, крови. Наружный фон капсулы будет представлен тканевыми клетками.

Микропрепарат из культуры клебсиелл для обнаружения у них капсулы можно окрасить по методу Бурри – Гинса:
1. На чистое предметное стекло наносится небольшая капля черной туши и капля взвеси суточной агаровой культуры капсульных бактерий. Смесь осторожно перемешивается петлей , после чего другим предметным стеклом делается мазок, подобно мазку крови.
2. После подсушивания на воздухе и фиксации в пламени горелки препарат докрашивают в течение 2 – 3 минут карболовым фуксином Циля, разбавленным дистиллированной водой 1:1.
3. По окончании препарат осторожно промывается струей холодной воды, высушивается и микроскопируется. На темном тушевом фоне будут видны окрашенные микробные клетки окруженные бесцветной капсулой. При отсутствии капсулы, к клетке окрашенной фуксином, черный фон примыкает вплотную.

В том случае, если микропрепарат готовится из исследуемого материала, мазок может быть окрашен одним анилиновым красителем, по методу Грамма, по методу Романовскго – Гимза. В каждом из этих трех споосбов окраски на фоне окрашенных тканевых клеток, будет видна бесцветная капсула, окружающая окрашенную микробную клетку. Обнаружение спор.

Благодаря толщине свое оболочки и плотности содержимого, споры остаются неокрашенными при обработке препарата анилиновыми красителями простым методом или сложным по Граму.

При окраске по Граму или по Леффлеру спора внутри окрашенной цитоплазмы микробной клетки выглядит как зернышко круглой или овальной формы, сильно преломляющее свет.

Существует несколько методов окраски спор (по Циль – Нильсену, по Ганзену, по Ожешко и др.) позволяющих достигнуть контрастной окраски спор в цитоплазме.

Методика окраски микропрепарата:
1) На фиксированный препарат накладывается полоска фильтровальной бумаги (для защиты препарата от оседающих кристаллов красителя) и на нее наливается карболовый фуксин Циля. Препарат осторожно прогревается в течение 3 – 4 минут над пламенем горелки. По мере испарения жидкости краситель добавляется.
2) Фильтровальная бумага снимается и на мазок наносится 2 – 3 капли 5% раствора кислоты (серной, соляной, азотной или уксусной) на 30 секунд.
3) Препарат тщательно промывается струей холодной воды и высушивается.
4) Докрашивается раствором метиленовой сини Леффлера в течение 1 – 2 минут.
5) Препарат промывается струей воды, высушивается и микроскопируется. На голубом фоне цитоплазмы видны сиренево – красные споры.

Этот метод позволяет обнаружить споры не только в процессе их формирования внутри клетки, но и после того как сформированная спора высыпалась из разрушившейся микробной клетки.

Приготовление карболового фуксина Циля:
10 мл. насыщенного спиртового раствора фуксина растворяют в 100 мл 5% раствора карболовой кислоты.

Обнаружение зерен волютина

Зерна волютина (запасные вещества полифосфатной природы) можно обнаружить в клетках многих микроорганизмов.

У бактерий и актиномицетов гранулы волютина располагаются в цитоплазме, у дрожжей и грибов – в вакуолях. Как правило, зерен волютина больше в молодых клетках.

В неокрашенном состоянии крупные зерна волютина выделяются от остальной плазмы большей светопреломляемостью.. Однако лучше наличие зерен волютина определяется в окрашенных препаратах. Для обнаружения зерен волютина применяется окраска метиловой синью по Леффлеру. Зерна волютина при этом окрашиваются в сине – фиолетовый цвет, а протоплазма – в голубой.

Дифференциальная окраска зерен волютина может быть достигнута различными способами окраски, в том числе и способом Нейссера (Neisser). Нейссер разработал и предложил для выявления зерен волютина в клетках дифтерийных бактерий.

При окраске по способу Нейссера зерна волютина окрашиваются в синий или темно – коричневый цвет, а протоплазма – в светло – коричневый.

Зерна волютина можно выявить окраской по способу Омелянского. Для этого на фиксированный мазок наливают карболовый фуксин Циля на 30 секунд. После чего краску сливают, препарат промывают водой и обесцвечивают в течение 30 – 40 секунд 1% раствором серной кислоты. Затем кислоту сливают, препарат промывают водой и докрашивают метиловым синим в разведении 1:40 в течение 30 секунд. После промывки водой препарат высушивают и микроскопируют.

Зерна волютина при этом способе окраски окрашиваются в сиренево – красный цвет и хорошо видны на фоне синей цитоплазмы.

При окраске препарата по методу Грама зерна волютина по тональности и интенсивности окраски не дифференцируются от цитоплазмы, поэтому окраску по методу Грама для выявления зерен волютина применять не имеет смысла.

У некоторых микроорганизмов запасные вещества накапливаются в виде гранул углеводной природы. Их можно выявить при обработке клеток раствором Люголя. Гранулы крахмалоподобных веществ окрашиваются в синий, а гранулы гликогеноподобных полисахаридов – в красновато – коричневый цвет.

Окрашивание микропрепаратов из исследуемого материала

Микропрепараты из крови окрашивают по Романовскому – Гимза, фуксином, метиловым синим или другими анилиновыми красителями.

Для наблюдения вегетативных стадий кишечных простейших пользуются прижизненной окраской паразитов раствором Люголя, слабыми растворами основных красителей (эозин, метиловый синий и др.) в разведении 1:1000 и даже 1: 10000. Для более подробного изучения паразитов, препараты фиксируют жидкими фиксаторами (жидкость Шаудина, метиловый или этиловый спирт) и окрашивают гематоксилином, метиловым синим, фуксином, краской Романовского.

При микроскопическом исследовании мазков мочи, спинномозговой жидкости, мокроты фиксированные препараты окрашивают по Граму, по Романовскому — Гимза, метиловым синим

Фиксированные микропрепараты из гнойного содержимого язв, пунктатов бубонов, лимфатических узлов в зависимости от предполагаемого возбудителя окрашивают по Граму, по Бури, по Романовскому – Гимза, серебрением по Морозову.